Доказательства спороцидности Тефлекс под микроскопом

Методики определения спороцидной активности и электронно — световой микроскопии (из отчета из ВНИИЧБ)

В работе были использованы музейные штаммы бактерий: Bacillus subtilis (ATCC 6633) и Bacillus cereus (619). Дезинфекционную активность препарата «Тефлекс А» оценивали по отношению к споровой форме обеих культур.

Для получения споровой суспензии культуры микроорганизмов засевали методом Дригальского на чашку Петри (агар Хоттингера) и выращивали до образования характерных колоний. Несколько отдельных колоний (не менее пяти) отбирали для дальнейшего роста, засевали пробирки со скошенным агаром Хоттингера и выращивали при температуре (25 ± 1)⁰С суток до образования вегетативных клеток. Через 2 суток, косяк смывали стерильной водой и полученной бактериальной суспензией засевали чашки Петри с рыбо-киличным агаром, чашки помещали в термостат при температуре (25±1)⁰С и выращивали в течение 5−7 суток до процесса спорообразования. В процессе выращивания проводили контроль морфлологических свойств культуры методом световой микроскопии путем анализа фиксированных мазков, окрашенных по методу Смирнова. При достижении в поле зрения процентного содержания спор до 80−90%, микробную массу смывали дистиллированной водой. Полученную взвесь спор прогревали при температуре (80±1)⁰С в течение 30 минут. Затем прогретой споровой суспензией вторично засевали чашки Петри с рыбо-киличным агаром и выращивали в течение 5−7 суток до образования спор. Процесс спорообразования контролировали методом световой микроскопии. Полученную споровую суспензию смывали дистиллированной водой и вторично прогревали на водяной бане при тех же условиях. Полученную взвесь спор разливали в пенициллиновые флаконы, плотно укупоривали и хранили при температуре (4±1)⁰С. Концентрация спор составляла 10⁸ спор/мл.

Спороцидную активность препарата «Тефлекс А» оценивали следующими методами:

по величине зоны отсутствия роста микроорганизмов (зона лизиса) после нанесения капель тестируемого препарата на поверхность агара с газоном B. сereus.

Для получения газона культуры споровую суспензию (1×10⁶ КОЕ/мл) в объеме 0,3 мл наносили на чашки с агаром Хоттингера. Суспензию равномерно распределяли шпателем по поверхности агара, газон подсушивали, затем на поверхность газона капельным методом наносили рабочие дезинфицирующие растворы в объеме 20 мкл. Рабочие дезинфицирующие растворы со следующими концентрациями действующего вещества — 2%; 1,5%; 1,3%; 1%; 0,8%; 0,5%; 0,4%; 0,2%; 0,1%; 0,05% - готовили из исходных препаратов путем разведения с использованием стерильной дистиллированной воды. В качестве контроля использовали стерильную дистиллированную воду, нанесенную в том же объеме на газон культуры.

Чашки помещали в термостат при температуре +30±1⁰С. Степень дезинфицирующей активности тестируемых растворов оценивали по зонам лизиса .

количественного суспензионного теста.

Споровую суспензию Bacillus subtilis (1×10⁷ КОЕ/мл) в объеме 1 мл смешивали с раствором БСА (0,3 г/л), инкубировали в течение 2 минут на водяной бане при температуре +20±2⁰С. Затем добавляли 8 мл 0,5% раствора препарата «Тефлекс А». Контакт дезинфектанта со спорами осуществляли при постоянном перемешивании при температуре +20±2⁰С. После окончания экспозиции действие дезинфектанта останавливали раствором нейтрализатора (30г/л полисорбата-80 +3 г/л лецитина). Каждую пробу раститровывали методом серийных разведений и проводили высев на твердый питательный агар Хоттингера. Чашки помещали в термостат при температуре +30±1⁰С. Оценку спороцидной активности препарата проводили производя подсчет КОЕ.

Споровую суспензию Bacillus cereus (5×10⁶ КОЕ/мл) в объеме 1 мл смешивали с 1 мл 0,1% раствора препарата «Тефлекс А». Контакт дезинфектанта со спорами осуществлялся при постоянном перемешивании при температуре +20±2⁰С. Остановку дезинфицирующего воздействия препарата на споры Bacillus cereus по истечении времени контакта осуществляли путем отмывки в 10-кратном объеме стерильной дистиллированной воды с последующим центрифугированием и ресуспендированием бактериального осадка спор в 2 мл стерильной дистиллированной воды. Затем каждую пробу раститровывали методом серийных разведений и проводили высев на твердый питательный агар Хоттингера. Чашки помещали в термостат при температуре +30±1⁰С. Оценку спороцидной активности препарата проводили производя подсчет КОЕ.

электронно-световой микроскопии.

Образцы спор B. cereus, после воздействия дезинфектанта, фиксировали в течение 10−12 часов при температуре +4⁰C в 2,5% растворе глютаральдегида на фосфатном буфере (0,15 М, pH — 7,2). Затем два раза промывали в фосфатном буфере и постфиксировали в 1% водном растворе OsO₄ в течение 4 часов. После выдержки образцы двукратно промывали стерильной дистиллированной водой, затем их обезвоживали в серии растворов этанола восходящей концентрации (30%, 50%, 70%, 96%). Время выдержки образца для каждой концентрации этанола составляло 60 минут. Далее спирт в образцах замещали окисью пропилена.

Пропитывание образцов эпоксидной смолой Araldite проводили по следующей схеме:

Araldite + окись пропилена в соотношении 1/3 — 2 часа при комнатной температуре.
Araldite + окись пропилена в соотношении 1/1 — 2 часа при комнатной температуре.
Araldite + окись пропилена в соотношении 3/1 — 2 часа при комнатной температуре.
Araldite- 2 часа при температуре 50⁰C.

Затем образцы помещали в специальные формы и заливали свежей порцией эпоксидной смолы Araldite. Полимеризацию смолы проводили при температуре 60⁰C в термостате в течение 8 часов.

Из заливочных блоков готовили ультратонкие срезы с помощью алмазного ножа на ULTRATOME III (LKB). Полученные срезы контрастировали 1% водным раствором уранилацетата в течение 10 минут, затем цитратом свинца (по Рейнольдсу) в течение 5 минут. Готовые препараты просматривали на электронном просвечивающем микроскопе JEM-100C при ускоряющем напряжении 80 kV.